揭穿一个忽悠人的错误标准(2)
揭穿一个忽悠人的错误标准（作者：张世煌）二、深入解析
（1）分子指纹与SSR标记技术。
在分析遗传多样性的时候，SSR标记是非常有效的工具，它的作用就好比是指路标；但20对引物在玉米基因组的涵盖性实在不足，作为衡量品种权纠纷案件的标准甚至不具备使自己成为标准的基本条件。品种之间SSR等位基因的差异不能确切反映表型差异，说明这类“路标”式检测工具的代表性不足，分析方法本身不具有行业标准所需要的唯一性、确切性和普遍适用性，更不等同于品种DUS测试的特异性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和稳定性(Stability)。它可以作为判断纠纷案件的辅助手段，但不可能制定普遍适用的标准指纹。如果强行造出一个“标准”的指纹数据库，可能大量信息无用，你还必须得做，而真正有用的信息却不在数据库，于是稍有疏忽就会误判。在农作物品种区试和审定实践中，这类误判最常见。（区域试验和品种审定把不是标准的“标准”等同于DUS，然后绝对化，或者草菅品种或者为侵权大开方便之门，两件不该做的事都被他们稀里糊涂地做了。那些官员到底上了谁的当呢？）
很多年前(2002-2005)，在讨论制定标准的原则和项目分工时，我和一些专家指出了路标式标记的缺陷，赵氏团队不理解，他甚至以为两条SSR谱带等同于DUS测试的两个性状。借助于个别人的违规操作，他们刻意回避了专家意见，暗中搞出那个漏洞百出、忽悠人的错误标准。基于这个标准建立的数据库必然不靠谱。
人是渺小的，切不可玩弄客观规律，玩弄规律，必遭惩罚。
世界“最大”的数据库为什么不靠谱呢？问题出在那个忽悠人的标准用20对SSR引物，涵盖不了已知数百万的SNP变异。且不说SSR标记的位点基本上位于重复序列，不代表基因的生物学功能。另一个证据对Z氏标准更不利。二十多年来积累的分子标记遗传信息表明，现代玉米自交系之间的遗传相似性通常在70%，甚至多数在80%以上；但如此高的分子标记遗传相似性并不影响自交系之间农艺性状的千差万别。
在做DUS检测或用SSR引物作指纹分析判断侵权案件时，针对性很强，无论从法律还是技术层面来说，通常是一对一，没必要劳民伤财地为不可预知的事件制作缺乏涵盖性和漏洞百出的短命的指纹数据库。
赵氏标准的特点决定了依照该方法只可以单方向做出判断，而不能反向外延。这意味着可以作为判断同一性的辅助手段，但不唯一也不恒定，缺乏涵盖性，这就需要对每一次DNA检测数据经过统计学检验，还须经过专家组论证才可做出判断。专家论证，主要是核查每一次检测实验设计的可靠性和对数据解释的合理性，防止发生明显的欺骗性错误。
典型案例是北京某实验室为兰州市中级法院审理奥瑞金一个玉米品种权纠纷案件时，用20对SSR引物竟然检测出72条谱带！除非用了40对引物，否则扩不出这么多谱带！那只能是严重的操作失误，据此写出的检测“报告”形同废纸（请阅读延伸讨论2）。当这个检测报告被揭穿以后，他们再出具报告的时候，就蛮不讲理地只写一句话的结论，再不出示证据！
在编制标准的时候，不做调查研究，未做专门试验，没有限定计算方法，标准编出来后未经过专家充分论证。一些专家教授知道这方法有毛病，但默不作声。现在是该澄清的时候了。
判断品种是否唯一的途径是逻辑学的同一性，只要发现一个同一性样本，那个品种就不唯一。目前主要依据DUS测试，这样一来，剽窃式育种就无处藏身。遇到DUS测试不能解决的纠纷时，可采用分子指纹作为辅助判断。这一判断过程是单方向的，需要外延时，20对（或40对）SSR引物远远不够。所以，今后不要滥用分子技术，更不必预设没有针对性而忽悠人的赵氏数据库。
下面说一说忽悠人的错误标准如何打压商业育种的积极性，同时也为剽窃育种打开方便之门。（请参阅延伸讨论3和4）
在水稻、小麦、玉米等主要农作物品种区域试验时，经常遇到外观明显不同的品种，却找不出SSR位点差异，反过来也经常遇到另一种情况，表型看不出差异，却很容易找到多个SSR位点差异，甚至稍做手脚就可以人为制造出差异来。在过去几年的品种区域试验和审定管理中，许多品种被冤枉，也有一些剽窃式品种轻易过关。这说明忽悠人的赵氏方法本身有漏洞。这个技术漏洞给个别人堂而皇之地公然侵犯知识产权制造了法理基础。在这过程里使用了偷换概念的手法。不夸张地说，那些掌握了现代分子生物学知识但居心不良的育种者，依赵氏标准，可以轻而易举地侵占任何一个优良杂交种的知识产权。在中国，这种事情已经发生！所以，忽悠人的赵氏标准必须废除。
玉米85%以上的DNA序列属于功能基因之间的重复序列，它们在育种过程里不曾受到选择压力，因此，它们之间的多态性被认为是中性变异，没有育种学含义和农学意义，也没有适应性进化意义。大部分SSR标记就位于这些非功能区的简单重复序列。这是SSR指纹不适合作为品种保护识别标准的重要原因。
个别人搞剽窃式育种，他们想制造2条以上SSR谱带差异很容易……，忽悠人的错误标准给剽窃式育种开了方便之门。个别老实巴交的育种者培育若干个姊妹品种，差异主要在基因的功能区域，而在85%非功能区重复序列中的20个位点上没有差异，就可能被冤枉。
被冤枉的育种者可以退一步换位思考，如果你确信某一姊妹系优于已经审定的姊妹品种，你就用那些被忽悠人的赵氏标准否定的姊妹品种互通使用，反正都是你育成的；这是商业育种，不同于科研单位，用不着非要重新冠名，不必重新审定和再申请新品种保护。种子管理部门不要两头堵。你从一头堵截了，就要放开另一头。总要让育种者有活路。育种者要善于以子之矛，陷子之盾。
（人有鬻矛与楯者，誉楯之坚：“物莫能陷也。”俄而又誉其矛，曰：“吾矛之利，物无不陷也。”人应之曰：“以子之矛，陷子之楯，何如？”其人弗能应也。以为不可陷之楯与无不陷之矛，为名不可两立也。《韩非子·难一》）
隐含的技术问题不可忽视。在做PCR的时候，如果操作不严，容易发生交叉污染，DNA样本中可能含有细胞质DNA片断，在PCR时这些片段容易发生交换，于是电泳后产生不该出现的异常情况。20对SSR引物在一个杂交种内“检测”出72条谱带，可能就是这么来的，但也可能出现了更不可饶恕的低级错误。这类低级错误通常不可重复，把同一套样本送到另一个实验室去对照检测，甚至只要把数据和照片送到另一个实验室去核对，就能发现和剔除这类错误。
（2）遗传差异的临界值标准。
设置遗传差异临界值是基于衍生品种的概念。促进商业育种发展，就必须消除两头堵（也是两头漏洞），达到既保护知识产权，还要鼓励创新的目的。
有人提出把两个位点改成五个，虽然增加了剽窃育种的难度，但仍可以造假；更重要的是，会把老实巴交的育种者彻底整死。不管是两个位点还是五个位点差异，都会出现两头堵。这种不确定性是由标记的局限性决定的。SSR标记分布在功能基因以外的重复序列，即使很多位点的中性突变造成非选择性差异，又能说明什么？如果换成SNP芯片技术，可以在功能基因内找到海量变异位点，但需要多少个这类变异（或概率）才算是新品种？玉米基因组有二万多个基因，每个基因内部有很多SNP，根据什么确定阈值？每个多态性变异各具有什么遗传学意义？基本原理尚不清楚，能用来作为测试依据吗？十年前，我们用上百个SSR标记分析不同来源的丹340样本之间等位基因的遗传相似性大约94%；那算怎么一回事？算不算是你搞出若干个新自交系？
分子生物学技术发展很快， SNP芯片技术并没有到顶，新一代标记技术已经出现，现在还不能判断5年以后哪一种标记技术更先进，更实用。但我们知道，SSR数据库早已经过时；SNP数据库正在用于辅助育种；分子标记技术很快就有新发展。未来鉴定品种间的差异，或许还可以通过全基因组深度重测序来解决。
就目前来说，忽悠人的赵氏标准已经面临尴尬，基于大量分子标记分析，商业自交系之间的遗传差异不超过30%，而个别自交系（如丹340）内部却出人意料地有较大差异。所以，随意设定五条谱带差异作标准是没过脑子却硬要拍脑袋的长官意识。我们要明白，现代生物技术不是用来为剽窃行为作保护伞的！少数人欺骗大众很容易，但要揭穿它也不难。就看你想不想揭穿。
如果计算5个位点差异，结果真实（不做手脚），那就意味着品种之间的遗传相似性低于75%才算是一个新品种！这对玉米育种是一个了不起的事件，现有大多数自交系和品种都要被枪毙掉。而水稻品种恐怕全都过不了这一关！很多年以前，我们针对中国自交系的试验数据测算，把遗传相似性临界值定在93%（法国92%），而美国先锋公司则定在87.5%。现在冒出一个75%，比先锋公司还让人不可接受！这意味着中国人不要搞育种了！绝大多数自交系都跳不出如来佛掌心。这就为玉米育种制造了人为障碍，到那时候没有东西可剽窃，也不会再推出新品种。无论两个位点还是五个差异，都会让育种者左右为难，也让管理者进退两难。种子局应广泛调研，充分论证，想好了再表态。（注：即使从40对引物中找出5个位点差异，仍然是两头堵，使主要农作物很难再搞育种。）
某跨国公司一个品种参加我国玉米品种区域试验，被某实验室用20对SSR引物判定为侵权，那家公司通过2000多对SNP引物分析提出强有力证据指出参试品种与原品种的相似率只有81%，最后有关部门不得不允许人家继续参加区域试验。某公司的品种被侵权，样本送到三个实验室用同样的方法检测，却得出三个不同的结论。这两个尴尬案例应引以为训，分析赵氏标准到底错在哪里。
我们提出93%这个临界值很耐人寻味。品种之间的差异只有超过7%才算是一个新品种，而低于这个临界值，则属于原始育种者的品种权范围。为了更有利于鼓励创新和保护知识产权，或许应该接受法国92%的临界标准。有一个获得国家一等奖的育种者很聪明，他持续改良获奖品种的亲本自交系，我们应该认可他这么做，因为这是商业育种，法规不应该两头堵，也不应该两头有漏洞。如果分子标记的遗传差异在7%以内，仍算是原品种，不必重新审定和另外申请品种权保护。这就限制了侵权育种。如果对一个亲本回交一次尚可行，回交两次育成的自交系再配原组合，就难逃侵权。按照先锋公司12.5%的标准，回交一次都有风险。近年来，黄淮海地区出现剽窃式育种，如果差异没有超过7%，改良后的品种权仍属于原品种权人。东北现在也出现了针对德美亚系列的剽窃式育种，很容易找出2个位点差异，但扩大引物范围，譬如用数千对引物，剽窃育种便逃不出7%这个临界值。这才是如来佛的掌心！保护知识产权的利剑不能只控制在美国人手里，也要握在我们自己手里。种子管理部门应通过法律法规和技术途径打击育种中的侵犯知识产权行为。
当发生剽窃事件的时候，DUS测试就可以揭示真象，DUS测试解决不了的纠纷，才有必要动用分子指纹作为辅助参考。截至目前，已经在功能基因内发现大量SNP多态性，以后这种多态性越来越丰富，利用SNP芯片技术很容易揭示品种之间的多态性，而且避免对育种家两头堵的现象，实在没必要花很多钱建立没有预知用处和水平很低的数据库。随着芯片技术日新月异，今天做出的SSR数据库，已经失去意义，许多数据永远也没有用处。
最近有研究解释了玉米自交系基因组间大小不同的原因，这与进化和选择有关。每个自交系都有其自身特征，但要想找到真正可靠且能够区分不同品种的分子数据，基因芯片技术也只能作为一个初级的分析方法，更不要说SSR这种路标式的检测标记。采用芯片技术很容易找到差异，但要想在功能基因组水平解释不同自交系和品种间的差异，就需要做进一步的功能基因组分析。对行业负责、对法律负责，才能够经得起历史检验。
现在已进入基因组时代，仅仅通过引物组合法或者核心引物组合法识别多态性，其出发点是为了找差异而区分差异，不可能为判断品种同一性提供可靠的数据支持。出现品种权纠纷，应具体问题具体分析，针对涉案品种，在功能基因组水平进行深入分析，还需要做生物信息处理，才能明确解释特异性。
好在目前这种检测大多数是一对一，当需要检测时，很容易设计和实施，不需要不靠谱和忽悠人的赵氏数据库。几年以后商业育种发达，市场管理趋于规范，分子指纹技术使用的概率会很低。但有人希望政府投钱做些没用的事来养活他们。这跟科技洗钱差不多，所以他们需要搞低水平的分子指纹库。现在这个数据库已经没有用处，估计他们又会建议政府再上新项目，制造另一个忽悠人的数据库取而代之。没用的事情就可以这么循环往复地做下去。
前面说到一些特殊处理，就可以诱导出若干条SSR谱带的差异，除了操作方法有漏洞，还有一个至今尚未搞清楚的遗传现象。常见的特殊处理往往是物理因素，不伤及核DNA结构，但逆境因素却容易诱导核外DNA发生变化，引发可见的表型变异。如果因操作人员注意不到的环境因素导致核外DNA或RNA发生变化，在操作不严格的情况下，就会留在DNA样本中，其中个别片段经过交换被某个引物扩增，就会造成混乱。这属于应该避免而没有避免的操作失误。多次发生这类失误，找不到原因，或者干脆就不找原因，说明那家试验室不具备给司法机关或其他机构出具检测报告的资质，也不适合参与品种审定之前的DNA检测。
在废除忽悠人的错误标准之前，建议种子管理部门选择若干家实验室进行类似工作，每批样本同时送到两个实验室分别进行检测；育种者对检测结果有申诉权利；同时，对每次一对一的检测报告都经过专家组监督、审核和论证，以防止出现低级错误或个别人继续招摇撞骗。
2013年4月9日（待续）
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